Пульс-электрофорез и методы работы с большими молекулами ДНК

ДНК с большим молекулярным весом удается получить при обработке коллагеназами, гомогенизировании, трипсинизации или просто разрезании материала, помещенного в раствор ESP. Можно вначале выделить из клеток ядра, а затем из них приготовить вставки с образцами. 3. Работа с агарозными блок-вставками, содержащими образцы ДНК Для многих целей удобнее и проще иметь дело с ДНК, заключенными в агарозный гель, чем находящимися в растворе. Низкомолекулярные компоненты свободно диффундируют через агарозу при мягком перемешивании. Мы работали с 100 мкл-агарозными блок-вставками просто как с жидкими образцами объемом 100 мкл. Возможность обрабатывать ДНК ферментами непосредственно в агарозе зависит от типа агарозы. По крайней мере, половина партий агарозы содержит примеси, которые не позволяют ферментам эффективно работать. Компания FMC выпускает агарозу с низкой температурой плавления, специально проверенную на пригодность к рестрикционной обработке заключенных в нее молекул ДНК. 3.1 Ферментативная обработка Для ферментативной обработки ДНК, содержащейся в блок-вставке, необходимо предварительно инактивировать протеинкиназу К, оставшуюся после приготовления образца, и убрать диализом ЭДТА и детергенты. Протеиназа К весьма устойчивый фермент и может оставаться активной в растворе ESP при 4°С по крайней мере 1 год. Однако она полностью инактивируется при обработке фенилметилсульфонилфторидом, который крайне нестабилен и свежий раствор, которого поэтому надо добавлять ежедневно. Любая остающаяся во вставке протеиназа К разрушит вносимые ферменты. Необходима чрезвычайная аккуратность, чтобы не загрязнять лабораторный стол и используемое оборудование протеиназой К. В правильно выбранной агарозе эффективными будут если не все, то большинство рестриктаз. Когда рестриктазы не активны в агарозе, они, как правило, не проявляют активность и в растворе. Обычно мы используем соотношение фермент: ДНК, равное 20: 1. В большинстве случаев это соответствует по крайней мере 10-кратному превышению над реально необходимым количеством фермента. Наш опыт, основанный на использовании ДНК и рестриктаз из различных источников, а также опыт других исследователей подсказывает, что именно такой подход гарантирует полноту рестрикции. В случае низкой концентрации ДНК, особенно при работе с бактериями, может оказаться необходимым повысить концентрацию рестриктаз. Для частичного рестриктазного гидролиза необходимо титровать отдельные рестриктазы, добавляя различное их количество к вставкам с образцами ДНК и инкубируя в течение 2,5 ч.

Боги нового тысячелетия

Ученые называют геном «нашим наследственным генетическим посланием», или же «биологическим рецептом человека». Обычно приводят следующую статистику: ДНК каждой клетки в развернутом виде растянется на 6 футов (2 метра), а протяженность ДНК всего человеческого организма равна 8000 расстояний от Земли до Луны. С тех пор, как в 1953 году Уотсон и Крик открыли ДНК, открытия в области генетики посыпались как из ведра. Два крупнейших открытия ученые сделали в 1980 году и были удостоены Нобелевской премии по химии. Уолтер Джильберт из Гарвардского университета и Фредерик Зингер из Кембриджа совместно предложили быстрые методы прочтения больших отрезков ДНК, а Пол Берг из Стэнфорда впервые открыл процесс сращивания генов. Каким образом боги из плоти и крови пользовались генетикой, физически вмешиваясь в срздание человека? Давайте вкратце рассмотрим возникшие за последние двадцать лет три главные направления прикладной генетической науки: клонирование, сращивание генов и слияние клеток. Клонирование человека стало в научном отношении возможно уже много лет назад, хотя из этических соображений применялось оно только к животным ... »

Литература - Другое (книга по генетике)

При этом более короткие молекулы легче адаптируются к изменению условий и потому движутся в геле быстрее. Существуют различные варианты пульсирующего гель-электрофореза, главным образом, связанные с геометри- ческим расположением направлений полей - ортогональный, гексогональный, инверсионный. При использовании любого из этих вариантов могут быть разделены молекулы ДНК размером от 50 кб до более, чем 9 миллионов п.о. Эффективность разделе- ния фрагментов ДНК зависит не только от их размеров, но и от условий проведения электрофореза (напряжение, температура буфера, концентрация агарозы, время одного импульса). В ка- честве маркеров для определения величины больших молекул ДНК используют целые хромосомы дрожжей известной молекулярной массы. В дальнейшем отбор крупных фрагментов ДНК, несущих специфические последовательности, также может быть осущест- влен путем блот-гибридизации с ДНК-зондами. Разделенные и идентифицированные фрагменты ДНК могут быть элюированы из геля и использованы для рестрикционного картирования, пост- роения библиотек генов и для молекулярного клонирования с целью идентификации и изоляции генных последовательностей. открыть »

Большая Советская Энциклопедия (ФО)

Совокупность точек объекта, координаты которых известны, образует цифровую модель объекта, служащую для составления карты и решения различных инженерных задач, например для изыскания оптимальной трассы дороги. Кроме аналитических методов обработки снимков, применяются аналоговые, основанные на использовании фотограмметрических приборов – фототрансформатора , стереографа , стереопроектора и др. Щелевые и панорамные фотоснимки, а также снимки, полученные с применением радиолокационных, телевизионных, инфракрасных-тепловых и других съёмочных систем, существенно расширяют возможности Ф., особенно при космических исследованиях. Но они не имеют единого центра проекции, и элементы внешнего ориентирования их непрерывно изменяются в процессе построения изображения, что осложняет использование таких снимков для измерительных целей. Основные достоинства фотограмметрических методов работ: большая производительность, т.к. измеряются не объекты, а их изображения; высокая точность благодаря применению точных аппаратов и инструментов ... »

Что общего в иммунитете растений и животных

Это дало основание для шутливого высказывания известного иммунохимика о равновеликом расстоянии между тремя видами иммунитета - животных, растений и дипломатического (сейчас на слуху четвертый - иммунитет депутатский). Однако по мере углубления знаний о природе болезнеустойчивости, особенно с появлением методов работы с рекомбинантными ДНК, различия в механизмах иммунитета растений и животных перестали казаться столь разительными. Сейчас накапливается все больше данных о сходстве между ними. Об этом и пойдет речь. Иммуномодуляторы патогенных микроорганизмов Микроорганизмы, патогенные для животных и растений, выделяют в зараженные ткани и клетки метаболиты (иммуномодуляторы), влияющие на иммунные реакции. Одни из них, индукторы, или элиситоры, хозяин использует для распознавания чужого и индукции в организме защитных реакций. Эти вещества повышают устойчивость как к самим микробам, продуцентам элиситоров, так и к последующему заражению иными патогенными организмами, т.е. представляют собой один из факторов индуцированного приобретенного иммунитета. открыть »

Поваренная книга медиа-активиста

Об этом говорит главное из свершений, достигнутых "сетевым Амстердамом": создание в 1995 году бесплатного интернет-хостинга и провайдера xs4all.nl (что означает "Access for all", т. е. "доступ для всех"). Вводя в первый раз это понятие, центральное для всей книги, я хочу акцентировать именно то, что медиа-сцена была развита именно благодаря изначальному «альтруизму» голландских активистов. Провайдер xs4all в течение десятка лет — до его коммерциализации — обеспечивал бесплатный хостинг для множества цифровых «домов», домашних интернет-страниц пользователей независимо от их взглядов, гражданской принадлежности и пр., то есть буквально реализовывал метафору "цифрового города" (Digital city — dds.nl). Отсюда же возникло понятие "цифровая публичная сфера" ("digital public sphere", "digital public domain") — свободное сетевое пространство, предназначенное для обмена информацией и открытых дискуссий, которое надо охранять (в частности, от приватизации). Как этот подход — замечу в скобках — отличается от методов работы большой части российских активистов 90-х, которые готовы были кинуть и предать интересы солидарности и сотрудничества ради краткосрочных выгод, западных грантов, поездок за границу на конференции или рычагов иллюзорного «влияния» на каком-то ограниченном сегменте анархо-сцены! В начале 90-х понятие «тактические» в применении к медиа появилось как признание слабости маленьких медиа-групп и моментальных коалиций ... »

Ферменты

Тупые концы образуются при механическом разрыве больших молекул ДНК, при обработке ДНК с помощью рестриктирующих эндонуклеаз, дающих тупые концы, или при действии неспецифических ДНКаз. Например, если к одному набору фрагментов ДНК присоединить poly, а к другому – poly и смешать эти фрагменты, то произойдет их соединение друг с другом. Пробелы, образующиеся из-за неравной длины poly- и ро1уА) – хвостов, могут быть заполнены с помощью ДНК-полимеразы I, а концы соединены ДНК-лигазой. Такой подход использовался при конструировании первой рекомбинантной молекулы ДНК. И хотя открытие рестриктирующих эндонуклеаз сильно упростило процедуру получения липких концов при рекомбинации молекул ДНК i vi ro, иногда для их создания все еще используется терминальная дезоксинуклеотидил-трансфераза. РOLY-полимераза Подобно терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазе, po1y-полимераза присоединяет нуклеотидные остатки к 3'-концу цепи без участия матрицы. Однако po1y-полимераза проявляет специфичность в отношении РНК. Праймером является полирибонуклеотид, а субстратом – АТР. При этом G P, СТР, U P или dA P не могут заменить A P. Po1y-полимераза выполняет высокоспециализированную и важную функцию в экспериментах с рекомбинантными ДНК: ее используют для присоединения po1y-концов к молекулам РНК при синтезе кДНК. открыть »

Прыжки по хромосоме

Это пульс-электрофорез, «прыжки по хромосоме» и клонирование в клетках дрожжей. Важность этих подходов в том, что они дают ключ к пониманию молекулярных основ целого ряда генетических нарушений, для которых неизвестна функция кодирующих их генов. Известны наследственные болезни человека, связанные с аномалиями отдельных генов, такие, например, как муковисцидоз, болезнь Гентингтона, нейрофиброматоз. Наследование их происходит строго в соответствии с менделевскими правилами, они имеют четкие фенотипические характеристики, однако нормальные функции генов, кодирующих эти заболевания, не определены. Анализ сцепления с использованием полиморфных ДНК-маркеров позволил картировать соответствующие гены в специфических хромосомах человека, что в свою очередь, значительно увеличило возможности пренатальной и пресимптоматической диагностики. Чтобы до конца разобраться в природе этих заболеваний и предложить адекватные методы их лечения, необходим молекулярно-биологический метод, работающий в области больших молекулярных размеров. открыть »

Разделение белков по размерам с использованием DDC-Na

Этот революционный метод анализа ДНК будет рассмотрен в следующей главе. Сейчас же, прежде, чем перейти к электрофорезу в агарозе, я хочу познакомить учащихся и читателей с новыми идеями фракционирования крупных фрагментов ДНК в ПААГ с оригинальным использованием импульсов электрического напряжения, подаваемых на гель. Эти импульсы подаются поочередно в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Идея здесь заключается вот в чем. Даже очень длинная и гибкая молекула ДНК может протиснуться через относительно малые поры геля, если она вытянута в направлении продвижения к «основному» аноду, скажем, расположенному внизу пластинки. Напряжение на этот анод подается не постоянно, а импульсами. Второй, «вспомогательный» анод создает напряженность электрического поля, перпендикулярную основному направлению движения ДНК к низу пластинки. Напряжение на него подается тоже достаточно мощными, но более короткими импульсами, чем на основной анод, чередуясь с ними. Назначение «перпендикулярного» электрического поля состоит в том, чтобы поворачивать длинные молекулы больших ДНК так, чтобы в момент подачи «продольного» импульса они находились в положении, благоприятном для движения вдоль пластинки вниз, к основному аноду. открыть »

Селекция и трансплантация в скотоводстве

При этом генно-инженерные манипуляции (приемы работы, требующие большой точности) проводятся на фазе зиготы. Можно быть уверенным, что в ближайшей перспективе будут созданы новые формы крупного рогатого скота, обладающего рядом уникальных свойств, полученных методами генной инженерии (закономерности конструирования i vi ro рекомбинантных молекул ДНК и их поведение в реципиентной клетке). Уже накоплен большой опыт культивирования соматических клеток животных т i vi ro, разработаны способы длительного хранения клеток при низких температурах. Активно проводятся исследования и по культивированию генеративных клеток. Большое значение приобретает и метод агрегации ранних эмбрионов. Соединение двух целых эмбрионов от разных родителей позволяет получать животных, несущих качества сразу четырех родителей. Эти животные получили название химер. В настоящее время получены межвидовые (овца-коза) и межпородные химеры. В Германии (Брем) получили новое животное из двух половинок эмбрионов, взятых от животных разных пород. У нас в стране также получены химерные особи скота. Определение пола эмбриона основано на идентификации половых хромосом, полученных методом биопсии раннего эмбриона. Этот метод уже используется на скоте. открыть »

Биохимия нуклеиновых кислот

Что современная химия и биохимия умеют делать с нуклеиновыми кислотами Химия и биохимия нуклеиновых кислот не только углубили наши представления об огромной группе важнейших биологических процессов, связанных с сохранением, размножением и использованием наследственной информации, заложенной в генетическом материале клеток, но дали мощный импульс для становления современной биотехнологии с важными практическими выходами. Для того чтобы не вслепую манипулировать нуклеиновыми кислотами, было необходимо научиться изучать их структуру, прежде всего составляющие их последовательности нуклеотидов. Впервые ценой воистину героических усилий это было сделано для нескольких тРНК, состоящих из нескольких десятков нуклеотидов. Приятно отметить, что на первом этапе соревнования за установление первичной структуры тРНК в лидирующей пятерке была и группа советских ученых, возглавляемая А.А. Баевым. Однако созданные в ходе этих работ методы были настолько трудоемки, что для прорыва в исследование ДНК и больших молекул РНК они были непригодны. открыть »

Ответы на вопросы по генетике

Для изучения явлений наследственности и изменчивости используют биохимический, физиологический и другие методы. Практическое значение большое значение имеют теоретические исследования по проблемам инженерии в селекции растений, микроорганизмов и животных, разработке более эффективных методов и средств предупреждения болезней и лечения животных. Фундаментальные открытия в современной генетике реализуются в селекции растений, животных и микроорганизмов. Методы генетической инженерии широко применяются в биотехнологии. В животноводстве методы генетики используют: 1. При выведению линий и пород животных, устойчивость к болезням. 2. Для уточнения происхождения животных. 3. При цитогенетической аттестации производителей. 4. Для изучения влияния экологически вредных веществ на наследственный препарат животных. 2. Этапы развития генетики. Вклад отечественных учёных в развитие генетики В развитии генетики можно выделить 3 этапа: 1. (с 1900 по 1925 г.) – этап классической генетики. В этот период были переоткрыты и подтверждены на многих видах растений и животных законы Г.Менделя, создана хромосомная теория наследственности (Т.Г.Морган). 2. (с1926 по 1953) – этап широкого развёртывания работ по искусственному мутагенезу (Г.Меллер и др.). в это время было показано сложное строение и дробимость гена, заложены основы биохимической, популяционной и эволюционной генетики, доказано, что молекула ДНК является носителем наследственной информации (О.Эвери), были заложены основы ветеринарной генетики. 3. (начинается с 1953 г.) – этап современной генетики, для которого характерны исследования явлений наследственности на молекулярном уровне. открыть »

Эволюция живых организмов

Успех направленной эволюции определяется большим количеством ее участников. Для биохимика вполне обычно исследовать 10-13 разных молекул одновременно, и каждое новое поколение может существовать 1-2 дня (от момента отбора до создания нового поколения). Молекулярный биолог может читать гены какого-то организма как исторический документ, свидетельствующий об его эволюции, только написанный химическими компонентами молекулы ДНК, и такая информация может стать ключом для следующих этапов работы. Эволюцию в настоящее время можно продемонстрировать селекцией растений и животных, изучением адаптивной радиации, сравнительной биохимии и эмбриологии. В настоящее время исследуется и сам механизм, производящий эволюционные изменения. Учение Ч.Дарвина было названо Ф.Энгельсом одним из крупнейших достижений естествознания 19 в. Эволюционное учение в форме дарвинизма обосновало возможность использования исторического метода в приложении к природе, нанесло удар по религиозным представлениям о постоянстве и неизменности всего существующего, по идеалистическим и метафизическим взглядам на развитие органического мира. 2. Теория отбора А.А.Травина На основе теории эволюции Ч.Дарвина в 90-х г.г. появляется новая точка зрения ученого А.А.Травина на такой фактор эволюции, как отбор. А.А.Травин говорит, что сам Дарвин чаще употреблял термин типы отбора. открыть »

Строение и функции клетки

Главное отличие РНК от ДНК – одинарная, а не двойная цепочка молекулы. Различают несколько видов РНК, все они принимают участие в реализации наследственной информации, хранящейся в молекулах ДНК, через синтез белка. АТФ. Очень важную роль в биоэнергетике клетки играет адениловый нуклеотид, к которому присоединены два остатка фосфорной кислоты. Такое вещество называют аденозинтрифосфорной кислотой (АТФ). АТФ – универсальный биологический аккумулятор энергии: световая энергия Солнца и энергия, заключённая в потребляемой пище, запасается в молекулах АТФ. Энергию АТФ (Е) все клетки используют для процессов биосинтеза, движения нервных импульсов, свечений и других процессов жизнедеятельности. Новые открытия в области клетки.Раковые клетки.Два британца и американец разделят Нобелевскую премию за 2001 г. по медицине. Их открытия в области развития клеток, возможно, позволят разработать новые методы борьбы с раком.Как сообщил представитель Нобелевского комитета, ученые-медики разделят премию в $943 000. 61-летний американец Лиланд Хартвел работает в Исследовательском раковом центре Фреда Хатчисона в Сиэтле. открыть »

Методические приемы развития воображения и творческих способностей детей младшего школьного возраста на занятиях кружка декоративно - прикладного искусства по художественной обработке бересты

Как мы уже видели, решению задачи может препятствовать функциональная закрепленность, и не исключено, что во время инкубационного периода люди забывают старые и безуспешные способы ее решения. Еще одна гипотеза, объясняющая, как инкубация может помочь творческому процессу, полагает, что в этот период мы на самом деле продолжаем работать над задачей бессознательно. Такое представление сходится со знаменитым положением Вильяма Джеймса "Мы учимся плавать зимой и кататься на коньках летом" Наконец, во время перерыва в процессе решения задачи может происходить реорганизация материала. -Просветление Инкубация не всегда ведет к просветлению (мы все знаем много людей, которые пребывали в инкубации большую часть своей жизни, но до сих пор не достигли просветления). Однако, когда это происходит, невозможно ошибиться в ощущениях. Неожиданно "включается лампочка". Творческая личность может почувствовать порыв возбуждения, когда все кусочки и крупицы идеи вдруг встают на место. Все относящиеся к делу идеи согласуются друг с другом, а несущественные мысли игнорируются. Примеров просветления в истории творческих прорывов множество Открытие строения молекулы ДНК, открытие бензольного кольца, изобретение телефона, завершение симфонии, сюжет повести -все это примеры того, как в момент просветления в разум приходит творческое решение старой назойливой задачи. - Проверка. Вслед за радостным возбуждением, иногда сопровождающим проницательное открытие, наступает время проверить новую идею. открыть »

Химия. Белки

Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избирательному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов: которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. Строение коротких пептидов определяют последовательным отщеплением и идентификацией концевых аминокислот упомянутыми выше методами, а большие пептиды подвергают дополнительному расщеплению с последующим разделением и определением строения. Затем путем сложного сопоставления структуры различных участков пептидной цепи воссоздают полную картину расположения аминокислот в макромолекуле белка. Работа эта очень трудоемкая, и для определения химической структуры белка требуется несколько лет. Для изучения пространственной структуры белка, последовательности соединения аминокислот в том или ином белке используют различные физико- химические методы, из которых наиболее эффективными оказались метод ступенчатого расщепления и рентгеноструктурный анализ. открыть »

Театральная герменевтика и анализ театрального текста

Минимальная единица структуры ДНК - совершенно особое оригинальное образование, не имеющее аналогов в иных, не менее сложных органических молекулах. И выявить эту единицу удалось только тогда, когда ученые смогли взглянуть на молекулы ДНК как на единую сложную систему, собрав функционирующую аналогичную молекулу, поместив себя какбы внутрь живой клетки. Я полагаю, что многие проблемы театральной семиологии определяются точкой зрения на объект исследования. Исследователь, искусствовед, критик извне рассматривает уже готовый театральный текст, разлагая его разными методами анализа на составные части, тем самым разрушая целое и умерщвляя живое. Может быть, ему стоит попытаться самому выстроить новый театральный текст из различных компонентов, создать жизнеспособную функционирующую театральную систему, сделать спектакль и выявить эту минимальную единицу в процессе синтеза текста? Или режиссеру осмыслить свою работу? Этому, видимо, всегда мешало предубеждение режиссеров против теории («Наука иссушает искусство»). И неспособность теоретиков искусства самим создать художественное произведение, неспособность взглянуть на процесс творчества изнутри. Отсюда и представление о спектакле как о некоем «черном ящике». открыть »

Что хорошего в крупных клиентах

И нет ничего страшного в том, чтобы отказаться от работы с таким клиентом и «отпустить» его к конкурентам — пусть они несут убытки от работы с ним. Последнее утверждение, безусловно, верно для случая, когда крупный клиент не является составляющей вашего имиджа и/или деловой репутации. Если вам такие клиенты все-таки нужны, то пойдем дальше. Как организовать работу с крупным клиентом Все перечисленные выше особенности крупных клиентов, естественно, должны отражаться и на специфике работы с ними. Приготовьтесь к тому, что, так же как и в случае с госорганами, вам придется вносить значительные коррективы в привычные методы работы, затрачивать гораздо больше, чем обычно, сил и времени на отдельные операции и подолгу ждать результатов. Взаимодействие с крупными клиентами потребует от сотрудников вашей компании проявления качеств, достойных дипломата: разумного сочетания мягкости и настойчивости, терпения и такта, умения устанавливать личные контакты и способности постоянно «держать руку на пульсе». И первое из существенных отличий в организации продаж крупным клиентам заключается именно в поиске первичных контактов с ними. Поиск крупных клиентов Традиционные методы прямого маркетинга здесь мало применимы: всю присылаемую по почте рекламу в лучшем случае прочитают секретари, и они же попросят вас выслать всю информацию по факсу, вместо того чтобы соединить вас с кем-либо из сотрудников. открыть »

Волновой генетический код

Эти данные подтверждают ранние работы для агарозы и коллагена, где впервые обнаружен феномен аномально слабой затухаемости плотностных колебаний биогелей. Аномальное поведение ДНК зарегистрировали после наших наблюдений и японские авторы методом прямой регистрации броуновской динамики флуоресцентно-меченой ДНК. Причем, в работе японцев выявились и другие необычные особенности нелинейной динамики ДНК, которые не укладываются в хорошо разработанные теоретические модели Цимма и Роуза, но которые хорошо соответствуют нашим наблюдениям и трактовке молекул ДНК как структур, резонирующих на особые внешние волновые регуляторные сигналы (также см. ниже). Такая самоорганизация волновых процессов в ДНК может происходить и при таких физических условиях, когда существенную роль играют кооперативные процессы на уровне макромолекулярного континуума молекул ДНК, приближающегося к структуре хромосом. Чем более структура растворов ДНК отличается от архитектоники ДНК в хромосомах (в приводимых нами экспериментах это относительно короткие фрагменты полимера), тем менее существенны коллективные дальние (в масштабах макромолекулярных протяженностей полинуклеотида) взаимодействия между цепями ДНК, столь важные для эпигенетических функций генома. открыть »